血管基质成分联合脱细胞骨基质-壳聚糖支架修复桡骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2017.06.004

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：
脱细胞骨基质：是将骨中的活细胞杀死，脂肪皂化，在降低骨抗原性的同时又保留骨的原有结构、力学性质而得到的具有良好生物、理化性能的骨组织工程支架材料，保留骨的天然特性。
壳聚糖：是由自然界广泛存在的几丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的，化学名称为聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基- B-D葡萄糖，自1859年，法国人Rouget首先得到壳聚糖后，这种天然高分子的生物官能性和相容性、血液相容性、安全性、微生物降解性等优良性能被各行各业广泛关注，在医药、食品、化工、化妆品、水处理、金属提取及回收、生化和生物医学工程等诸多领域的应用研究取得了重大进展。

背景：研究表明，复合使用人工组织工程骨材料和脱细胞骨基质做为骨缺损修复的支架材料，可以综合两者的优点。
目的：进一步验证脂肪组织基质血管基质性成分联合脱细胞骨基质壳聚糖支架复合物修复兔桡骨缺损的安全性和生物相容性。
方法：取38只新西兰大白兔，其中3只用于脂肪组织血管基质成分的制备，3只用于脱细胞骨基质的制备，32只分为实验组和对照组，采用Brownlow法制备桡骨缺损型，实验组移植血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架，对照组造模后不做任何处理。术后2，4个月分别进行一般情况和大体观察、X射线拍照、病理观察、Lane-Sandhu 组织学评分。
结果与结论：①术后2，4个月2组无感染现象，但实验组的活动量和愈合程度显著性好于对照组；②术后2个月实验组骨缺损部位的X射线影像结果有显著灰白色的高密度影，术后4个月与正常的桡骨骨组织相同，对照组骨不连接；③术后2，4个月实验组病理显示骨组织生长情况显著性的高于对照组，Lane-Sandhu 组织学评分显著性的高于对照组(P < 0.05)；④结果说明，血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架修复兔桡骨缺损具有很好的安全性和生物相容性。

ORCID: 0000-0003-0670-5207(邵擎东)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 骨生物材料, 血管基质成分, 脱细胞骨基质, 壳聚糖桡骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: Artificial tissue-engineered bone combined with acellular bone matrix has been shown to be favorable for bone repair.
OBJECTIVE: To explore the safety and biocompatibility of the stromal vascular fraction of the adipose tissue combined with the acellular bone matrix-chitosan scaffold in the repair of rabbit radial defects.
METHODS: A total of 38 New Zealand rabbits were selected, 3 rabbits were used to extract stromal vascular fraction of adipose tissue, 3 used to prepare acellular bone matrix and 32 divided into experimental and control groups. Models of rabbit radial defects were established using Brownlow method. The rabbits in the experimental group were treated with the SVF of adipose tissue combined with the acellular bone matrix-chitosan scaffold, while those controls received no treatment. General situation, gross observation, X-ray examination, histological observation and Lane-Sandhu scores were performed at 2 and 4 months postoperatively.
RESULTS AND CONCLUSION: No infections occurred in both two groups at 2 and 4 months postoperatively, but the activity level and degree of healing in the experimental group were significantly better than those in the control group. In the experimental group, there were high-density shadows at 2 months postoperatively and the X-ray image of the bone defect site was the same as that of the normal one at 4 months, while bone nonunion occurred in the control group. The bone tissues in the experimental group grew significantly better than that in the control group at 2 and 4 months postoperatively, and the Lane-Sandhu histological scores in the experimental group were significantly higher than those in the control group at 2 and 4 months postoperatively (P < 0.05). These results indicate that the stromal vascular fraction combined with the acellular bone matrix-chitosan scaffold exhibits safety and biocompatibility in the repair of rabbit radical defects.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Bone Matrix, Chitosan, Stents, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

邵擎东，汪铮，李宇飞，许天明，孙久一，江峰，吕峰霞. 血管基质成分联合脱细胞骨基质-壳聚糖支架修复桡骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2017, 21(6): 843-847.

Shao Qing-dong, Wang Zheng, Li Yu-fei, Xu Tian-ming, Sun Jiu-yi, Jiang Feng, Lv Feng-xia. Stromal vascular fraction combined with acellular bone matrix-chitosan scaffold for radical defect repair[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2017, 21(6): 843-847.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析实验选用32只白兔，分为2组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 两组兔术后一般情况及大体观察对照组与实验组兔在术后第2天均开始进食，术后7 d内所有兔的伤口愈合，伤口没有出现感染现象，术后7 d后2组兔均活动，但实验组的活兔的活跃程度高于对照组，术后2个月对照组的血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合物被骨茄样物质所覆盖，术后4个月对照组骨缺损部位完全愈合，与正常骨组织没有区别。对照组在整个观察期间，除了早期骨缺损两端有骨组织样的物质形成，骨缺损两端有一定程度的延长，在术后4个月骨缺损部位仍未愈合。

2.3 两组兔术后X射线拍照检查结果比较实验组术后2个月见到骨缺损部位移植的血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合物有显著地灰白色的高密度影；术后4个月骨缺损部位的X影像结果与正常的桡骨骨组织相同。对照组术后2个月骨缺损的两端有骨组织向中央延伸，有一定的骨钙化影；术后4个月骨缺损两端骨组织向骨缺损中央延伸的距离没有显著性的增加，但骨钙化影显著性提高。见图1。

2.4 两组兔术后病理切片比较实验组术后2个月有骨组织生长，可以见到骨小梁，骨板平面出现，可见少量长梭形细胞，中央管以及外围有层状排列的骨基质和生长在其中的骨细胞；术后4个月骨组织生长更加明显，骨小梁更多，骨板平面更加清晰，长梭形细胞数量显著性增加，中央管和外围排列更多的骨基质并且骨基质中的骨细胞数量显著增多。对照组术后2，4个月均只能见到少量的骨类和较多的纤维组织。见图2。

2.5 两组兔术后Lane-Sandhu 组织学评分比较实验组术后2，4个月的Lane-Sandhu 组织学评分均显著性的高于对照组同期评分。见表2。

参考文献

[1]赵艳红,杨强, 彭江,等. 新型脱细胞骨基质材料的组织学结构及其细胞相容性观察[J]. 中国修复重建外科杂志, 2013,27(7): 781-785.

[2]Datta P, Chatterjee J, Dhara S. Phosphate functionalized and lactic acid containing graft copolymer: synthesis and evaluation as biomaterial for bone tissue engineering applications. J Biomater Sci Polym Ed.2013;24(6): 696-713.

[3]Toskas G, Cherif C, Hund RD, et al. Chitosan(PEO)/silica hybrid nanofi bers as a potential biomaterial for bone regeneration. Carbohydr Polym.2013;94(2):713-722.

[4]Ariani MD, Matsuura A, Hirata I, et al. New development of carbonate apatite chitosan scaff old based on lyophilization technique for bone tissue engineering. Dent Mater J.2013; 32(2): 317-325.

[5]赵建辉,易成刚,邱璇,等. 基质血管成分与体外扩增的脂肪来源干细胞促进移植脂肪成活的对比研究[J]. 中国美容医学, 2013, 22(1):35-39.

[6]Brayfield C, Marra K, Rubin JP. Adipose stem cells for soft tissue regeneration. Handchir Mikrochir Plast Chir.2010;42 (2):124-128.

[7]张鲁华,杨飞,公衍道,等.壳聚糖和明胶材料对血管平滑肌细胞的作用[J].生物物理学报,2004,20(1):19-25.

[8]杰永生,綦惠,陈磊,等.脱蛋白联合冷冻干燥法制备异种骨的实验研究[J].中国医药生物技术, 2013,8(5):331-335.

[9]吴骁伟,王黔,曹谊林,等.组织工程骨血管化策略的研究进展[J] .组织工程与重建外科杂志,2015,11(5): 331-334.

[10]袁捷,祝联,王敏,等. 自体骨髓基质干细胞-珊瑚羟基磷灰石修复下颌骨节段缺损的实验研究[J].中华口腔医学杂志, 2006,41(2): 94-97.

[11]叶鹏,马立坤,黄文良,等. 骨组织工程三维复合支架修复兔桡骨骨缺损[J]. 中国组织工程研究,2014,18(3):383-388.

[12]沈丽丽.羟基磷灰石/壳聚糖复合微球的制备及其生物学作用的体外研究[J].安徽医科大学,2015.

[13]刘昊,张永刚 ,郭全义,等. 新型脱细胞骨基质－壳聚糖复合支架的生物相容性研究[J].中国矫形外科杂志, 2012,20(23): 2174-2178.

[14]刘昊,张永刚,郭全义,等. 新型脱细胞骨基质-壳聚糖骨组织工程支架的制备及性能评价[J].军医进修学院学报,2011,32(6): 616-619.

[15]黄皎,于湄,田卫东. 脂肪组织血管基质成分在组织工程化脂肪构建中的应用[J].国际口腔医学杂志,2016,43(1):74-78.

[16]强燕飞,王界欢,苏夏翔,等. 脂肪颗粒和基质血管组分的比例对兔移植存活率的影响[J]. 北方药学,2014,11(3):69-73.

引言

材料方法

1.1 设计随机分组动物体内实验。

1.2 时间及地点实验于2015年8月至2016年5月在解放军455医院完成。

1.3 材料兔龄2个月的健康新西兰大白兔38只，体质量为2.0-2.5 kg，雌雄不限，购于上海斯莱克实验动物有限公司。随机选取3只大白兔用于脂肪组织血管基质成分的制备，随机选取3只大白兔用于脱细胞骨基质的制备，剩余的32只大白兔随机分为实验组和对照组，每组16只。

1.4 实验方法

1.4.1 脂肪组织血管基质成分制备先取1只大白兔，另外2只备用，用20%氨基甲酸乙酯静脉麻醉，注射剂量为 5 mL/kg。备皮，取家兔背部皮下的脂肪约10 g，PBS冲洗3次至无血，将脂肪剪至尺寸约为1 mm×1 mm ×1 mm的碎块，在质量浓度为1 g/LⅠ型胶原酶溶液、温度为37 ℃条件下消化60 min。待块状脂肪组织转变为液态时加入2倍量的含有体积分数10%小牛血清的低糖DMEM培养基终止消化，用200目筛子过滤终止消化后的脂肪细胞溶液，以出去未消化掉的筋膜，过滤后用离心机在16 000 r/min的转速下离心5 min，PBS重悬并洗涤脂肪细胞沉淀，再次用离心机离心，去上清液，保留沉淀。将5倍量的红细裂解液加入到沉淀中裂解红细胞10 min，离心机在16 000 r/min的转速下离心5 min，PBS重悬并洗涤脂肪细胞沉淀，再次用离心机离心，去上清液，保留沉淀。加入含有体积分数10%小牛血清的低糖DMEM培养基至沉淀中重悬脂肪细胞，取 0.2 mL的细胞混悬液进行细胞活力和细胞数量检测。在 37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养。

1.4.2 脱细胞骨基质-壳聚糖支架制备耳缘静脉注射2.5%的戊巴比妥麻醉大白兔。取新鲜的股骨干，去除骨干周围的肌肉、血管、脂肪、筋膜等，并将股骨干截锯成规格为1 cm×1 cm×0.5 cm的小块骨，无菌水冲洗以除去骨中的脂肪、血液、骨髓等，冲洗后再在体积分数3%H₂O₂中浸泡2 h，更换H₂O₂后再浸泡2 h，无菌蒸馏水冲洗3次，2%十二烷基硫酸钠浸泡、振荡24 h，无菌蒸馏水冲洗10次，-40 ℃条件下冷冻干燥48 h，高速粉碎机粉碎骨至粉成10-50 μm颗粒。颗粒保存至-40 ℃条件下备用。脱细胞骨基质与5%壳聚糖溶液按照质量比10∶1的比例搅拌混匀，在1 000 r/min条件下离心3 min出去气泡，将除气泡后的混合均匀溶液倒入相应的模具中，于-40 ℃条件下冷冻2 h，在冷冻干燥机中冷冻干燥48 h，制成脱细胞骨基质-壳聚糖支架。将制备好的支架在254 nm紫外灯下照射8 h，照射后浸入50 mmol/L碳化二亚胺和20 mmol/L N-羟基琥珀酰亚胺溶液中于4 ℃条件交联24 h，无菌蒸馏水冲洗3次，冷冻干燥，⁶⁰Co消毒后密封，4 ℃条件保存备用。

1.4.3 血管基质成分-脱细胞骨基质-壳聚糖支架复合物制备取直径为4 mm、厚度为2 mm的脱骨细胞基质-壳聚糖支架经照射灭菌，将支架放入6孔板中，先用完全培养液预湿，然后将生长状态良好的脂肪组织血管基质细胞以3×10¹⁰L^-1的细胞浓度加入六孔板中，每孔加入5 mL。将六孔板置于37 ℃、体积分数5%CO₂的培养箱内贴附90 min，加入含有体积分数10%胎牛血清DMEM培养液继续培养72 h。每日用倒置显微镜观察细胞的生长状态及黏附支架上的情况。

1.4.4 兔桡骨骨缺损模型复制及修复 32只新西兰大白兔采用Brownlow法制备桡骨缺损型。耳缘静脉注射2.5%戊巴比妥麻醉实验组和对照组大白兔，麻醉后固定四肢，备皮，消毒，将所有兔的右侧下肢桡骨中远1/3部位截断，去除5 mm长度的骨质及骨膜，使用骨蜡封闭截断两端，使骨折部位保持有5 mm长度的间隙。随机将模型复制成功的大白兔分为实验组和对照组，每组16只。对照组仅打通骨折不愈合部位髓腔后缝合，消毒；实验组打通骨折不愈合部位后，植入血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖支架复合物，缝合，消毒。

1.5 主要观察指标

1.5.1 大体观察及影像学检查术后定期观察对照组和实验组大白兔活动、进食及伤口愈合情况，在术后2，4个月分别用X射线拍照检查兔骨折正位片，对比2组骨折愈合情况。

1.5.2 病理组织学检查分别在术后2，4个月后取对照组和实验组骨折部位桡骨，每组每次取8只大白兔，所取标本经体积分数10%甲醛固定、10%硝酸脱钙、脱水、石蜡固定后切片，二甲苯脱蜡，各级乙醇至水洗后风干，苏木精-伊红染色，脱水、透明、封固后在倒置显微镜下观察。

1.5.3 Lane-Sandhu 组织学评分术后2，4个月分别对对照组和实验组的大白兔的桡骨骨折部位进行Lane-Sandhu 组织学评分。见表1。

1.6 统计学分析实验中所收集到的数据均采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，以x(_)±s形式表示数据。使用t 检验对2组间均数进行分析，以P < 0.05作为差异有显著性意义的判定标准。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

骨缺损是骨科十分常见的病症，多说的骨缺损修复采用移植骨支架来完成。目前国内外关于骨支架材料的研究较多，由于人体骨骼的生物结构、物理结构具有复杂性和特殊性，很难可以确定一种可以作为骨缺损修复的骨支架材料^[6-7]。多数学者认为最理想的骨缺损修复的骨支架材料需要符合以下几点要求：①在具有一定的韧性的同时还需要具有相应的机械强度；②降解速率要合适，不能过快亦不能过慢；③生物相容性较高，不能有免疫抗原反应；④所制作的支架内部的结构要与正常骨骼内部的结构相似^[8-9]。

目前研究较多的骨支架材料主要有两大类——天然生物衍生材料和人工合成生物高分子材料。前者如脱细胞骨基质、壳聚糖、脱钙骨基质等，后者如磷酸三钙、聚乳糖、羟基磷灰石等^[10]。在上述的骨支架材料中脱细胞骨基质是将组织中的脂肪、骨髓、骨细胞等活性成分采用多种脱细胞的方法除去，仅保留细胞外基质的主要结构和成分，在消除骨组织的免疫抗原性的同时又可具有很好的骨传导和骨诱导特性，降解性以及生物相容性^[11]；而上述骨支架材料中的壳聚糖是将天然的甲壳素进行去乙酰化而得到的产物，壳聚糖具有十分良好的降解性、生物相容性、黏附性、可塑性。但当单纯使用壳聚糖做为骨支架材料时则会出现机械性差、降解速度过快的缺点^[12]。因此在使用壳聚糖做为骨支架材料时往往是和其他骨支架材料复合使用。刘昊等^[13]用新鲜猪骨细胞脱细胞制得脱细胞骨基质，再将骨基质与壳聚糖复合制成复合支架材料，实验表明该复合支架材料具有适宜的孔隙率和孔径以及良好的细胞相溶性；刘昊等^[14]将猪骨脱细胞骨基质与壳聚糖制成的复合支架移的生理盐水浸泡提取液耳缘静脉注入到新西兰白兔体内，实验结果表明骨基质-壳聚糖复合支架没有热源性、溶血性，同时细胞实验结果表明骨基质-壳聚糖复合支架没有细胞毒性，说明骨脱细胞-壳聚糖复合支架具有十分理想的生物相容性。本研究亦采用新西兰兔骨脱细胞骨基质和壳聚糖制得复合支架。

血管基质成分一种脂肪来源的间充质干细胞，其中含有丰富的脂肪来源干细胞。而脂肪来源干细胞具有多种特点，主要为：①在一定条件下不但可以分化为脂肪细胞而且可以促进脂肪细胞更新换代；②不但可以分泌多种血管生长因子，如肝细胞生长因子、基质细胞衍生因子1等，而且可以分化为血管内皮细胞，进而促进缺氧或损伤部位血管的新生；③在分化时虽然细胞数量不会增加和减少，但增殖分化功能可以维持；④提取方便快捷，而且含量丰富^[15-16]。如果选择适当的载体作为血管基质成分的细胞外基质，可以使脂肪来源干细胞增殖和分化。脂肪组织内含有多种数量较多的活性成分，如蛋白聚糖、纤维粘连蛋白、胶原等，这些活性成分可以提供很好的细胞外基质。

在研究中选择兔骨脱细胞基质和壳聚糖制得复合支架作为血管基质成分的载体移植到兔桡骨缺损，结果发现移植血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架术后伤口没有出现感染现象，术后的活动量显著地高于对照组，说明移植后生长状况良好，没有出现免疫排斥反应；术后对照组X射线拍照有显著地灰白色的高密度影，术后4个月骨缺损部位的X影像结果与正常的桡骨骨组织相同，2个月有骨组织生长，可以简单骨小梁，骨板平面出现，可见少量长梭形细胞，中央管以及外围有层状排列的骨基质和生长在其中的骨细胞；术后4个月骨组织生长更加明显，骨小梁更多，骨板平面更加清晰，长梭形细胞数量显著性增加，中央管和外围排列更多的骨基质并且骨基质中的骨细胞数量显著增多，术后实验组的Lane-Sandhu 组织学评分显著地高于对照组，说明复合支架具有十分良好的成骨作用和骨诱导活性。

综上所述，血管基质成分-脱细胞骨基质壳聚糖复合支架修复兔桡骨缺损具有很好的安全性和生物相容性，可以作为一种新型的骨缺损修复材料进行更深层次的研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程